Abstract

Multifunctional enzyme type 1 (MFE-1) is a monomeric member of the hydratase/isomerase superfamily (H/I) involved in the β-oxidation of fatty acids. MFE-1 has 2-enoyl-CoA hydratase-1, Δ3-Δ2-enoyl-CoA isomerase, and several other enoyl-CoA isomerase activities at the N-terminus. The C-terminus has (3S)-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity. MFE-1 can also convert certain hydroxylated C27 bile acid synthesis intermediates.

In these studies, a domain assignment of MFE-1 by sequence alignment with the H/I family (domains A and B in MFE-1) and mitochondrial monofunctional 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases (HAD, domains C, D and E) was proposed. This was further improved with the structural information obtained from the crystal structure of the construct containing domains B, C, D and E (MFE1-DH). The structure of MFE1-DH resembles the bilobal structure of the α-subunit of the bacterial fatty acid metabolising complex and the mammalian HAD enzyme. The N-terminal linker helix of MFE1-DH (domain B) corresponds to helix-10 of the hydratase/isomerase enzymes having residues important for substrate contacts. Domain C adopts the classical Rossmann fold and forms the first lobe of the MFE1-DH structure. The C-terminal domains D and E form the second lobe and have local symmetry between each other. This local symmetry corresponds to the D domain-mediated dimerisation of the HAD dimer. The domain deletion studies showed that the presence of domains D and E, but not domain C, was essential to obtain a functional hydratase 1 enzyme; this can be understood from stabilising contacts from domain E to the linker helix, as seen in the MFE1-DH structure.

The structure of human ACBP from liver was determined with and without a physiological ligand. This structure adopts the classical four-helix bundle of the ACBP family. The ligand binding mode seen in the presence of myristoyl-CoA shows that one ligand molecule is bound jointly by the two protein molecules of the asymmetric unit such that the fatty acid tail is bound by one protein molecule, and the 3'-phosphate AMP moiety of the CoA is bound by the other protein molecule, essentially as in known complexed ACBP structures in the monomeric binding mode. The observed ligand binding mode suggests a new model for the ACBP-mediated ligand transfer observed in biochemical in vitro studies.

Tiivistelmä

Tyypin 1 monitoiminen entsyymi (MFE-1) on hydrataasi/isomeraasiperheen (H/I) jäsen ja se osallistuu rasvahappojen β-oksidaatioon. MFE-1:n N-päädyssä on 2-enoyyli-CoA-hydrataasi 1- ja Δ3-Δ2-enoyyli-CoA-isomeraasiaktiivisuus sekä useita muita enoyyli-CoA-isomeraasiaktiivisuuksia. C-päädyssä on (3S)-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiaktiivisuus. MFE-1 voi myös katalysoida tiettyjen hydroksyloitujen C27-sappihapposynteesin välituotteiden reaktioita.

Tässä tutkimuksessa määritettiin MFE-1:n domeenirakenne H/I-perheen (MFE-1:n domeenit A ja B) ja 3-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiperheen (HAD, domeenit C, D ja E) sekvenssilinjausten perusteella. Rakennetta tarkennettiin domeenit B, C, D ja E sisältävän konstruktin (MFE1-DH) kiderakenteesta saadun tiedon avulla. MFE1-DH:n kiderakenne muistuttaa bakteerien rasvahappoja hajottavan kompleksin α-alayksikön sekä nisäkkäiden HAD-entsyymin kahdesta alayksiköstä muodostuvaa rakennetta. MFE1-DH:n N-päädyn α-kierre vastaa H/I-entsyymien kierre-10:tä, jossa sijaitsee substraattikontaktien kannalta tärkeitä aminohappotähteitä. C-domeeni muodostaa Rossmann-laskoksen ja se on MFE1-DH:n rakenteen ensimmäinen alayksikkö. C-päädyssä sijaitsevat D- ja E-domeenit muodostavat yhdessä toisen alayksikön ja niiden välillä on symmetria, joka vastaa D-domeenien välittämää HAD-entsyymien dimerisaatiota. Domeenitutkimukset osoittivat, että D- ja E-domeenien läsnä olo oli välttämätöntä hydrataasi 1:n toiminnalle, mutta C-domeeni voitiin poistaa ja säilyttää hydrataasi 1 -aktiivisuus. Havainto voitiin selittää MFE1-DH:n rakenteen avulla, jossa nähdään stabiloivia vuorovaikutuksia E-domeenin ja N-päädyn α-kierteen välillä.

Ihmisen maksan ACBP:n kiderakenne määritettiin fysiologisen ligandin kanssa sekä ilman ligandia. Tämä rakenne laskostuu ACBP-perheelle tyypilliseksi neljän kierteen nipuksi. Myristoyyli-CoA:n läsnä ollessa havaitussa ligandin sitoutumistavassa yksi ligandimolekyyli on sitoutunut kahden proteiinimolekyylin välille siten, että rasvahappo-osa sitoutuu toiseen proteiinimolekyyliin ja CoA:n 3'-fosfaatti-AMP-osa sitoutuu toiseen proteiinimolekyyliin kuten tunnetuissa monomeerisissä ACBP:n sitomistavoissa. Havaitun sitoutumisen avulla voidaan ehdottaa uutta mallia ACBP:n välittämälle ligandinsiirrolle, joka on havaittu aikaisemmin biokemiallisissa in vitro -tutkimuksissa.