Abstract Collagens are subject to extensive post-translational modifications, including the formation of 4-hydroxyproline, 3-hydroxyproline and hydroxylysine. These reactions are catalyzed by collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs), prolyl 3-hydroxylases (P3Hs) and lysine hydroxylases (LHs), which belong to the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase family and require oxygen for their reaction. 4-Hydroxyproline residues have for a long time been known to be required for the stability of the collagen triple helix, but the role of prolyl 3-hydroxylation was revealed only a few years ago when mutations in P3H1 and the consequent loss of a single 3-hydroxyproline in collagen I was shown to cause recessive osteogenesis imperfecta. In this thesis the human P3H isoenzymes were expressed as recombinant enzymes, and analyses of their tissue expression and kinetic properties revealed that P3H2 is located in tissues rich in basement membranes and that it hydroxylates collagen IV, the major basement membrane collagen. The roles of the collagen hydroxylases and collagen IV in basement membrane formation were further studied using Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells as an in vitro model for cell polarization. 4-Hydroxyproline also has a pivotal role in the system of cellular response to reduced oxygen levels (hypoxia). At a normal oxygen concentration, two proline residues in the α subunit of the hypoxia-inducible factor (HIF) are 4-hydroxylated by the HIF-P4Hs, which target HIF-α for proteasomal degradation. In hypoxia, the HIF-P4Hs are inactive, and the α subunit thus escapes degradation, dimerizes with a β subunit and after recruiting transcriptional coactivators induces the transcription of hypoxia-responsive genes in order to adapt the cell to hypoxia. Three human HIF-α subunits have been characterized to date, of which the third is known to be subject to extensive alternative splicing, with one of the splicing variants acting as a negative regulator of the hypoxia responsive system. Four novel splicing variants generated from the human HIF-3α locus are characterized here, and the expression of HIF-3α variants has been shown to be upregulated by hypoxia in a HIF-1 dependent manner. Further studies on the binding partners and transcriptional activity of HIF-3α revealed that this subunit has a more complex role in the adaptation of cells to hypoxia than had been expected.

Tiivistelmä

Kollageenit ovat valkuaisaineita, joihin kohdistuu useita synteesin jälkeisiä muokkauksia kuten 4-hydroksiproliinin, 3-hydroksiproliinin ja hydroksilysiinin muodostuminen. Näitä reaktioita katalysoivat kollageeniprolyyli-4-hydroksylaasit (C-P4H:t), prolyyli-3-hydroksylaasit (P3H:t) ja lysyylihydroksylaasit (LH:t), jotka kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaasien entsyymiperheeseen ja tarvitsevat happea reaktioonsa. 4-hydroksiproliinitähteiden on kauan tiedetty stabiloivan kollageeninrakenteen, kun taas 3-hydroksiproliinitähteiden merkitys on selvinnyt vasta viime vuosina. Mutaatiot P3H1-isoentsyymiä koodittavassa geenissä ja sen seurauksena yhden ainoan 3-hydroksiproliinitähteen puuttuminen kollageenissa I johtavat vaikeaan luustosairauteen, osteogenesis imperfectaan. Tässä väitöskirjassa ihmisen P3H:t tuotettiin rekombinanttiproteiineina. Tulokset paljastivat, että P3H2 ilmentyy erityisesti kudoksissa, joissa on paljon tyvikalvorakenteita ja että P3H2 hydroksyloi tehokkaasti kollageeni IV:n kaltaisia synteettisiä peptidejä. Lisäksi koiran munuaisten epiteelisoluihin pohjautuvaa in vitro-mallia käytettiin apuna tutkiessamme kollageeneja hydroksyloivien entsyymien ja kollageenin IV roolia tyvikalvon muodostumisessa sekä solujen polarisaatiossa. Kollageenia stabiloivan tehtävänsä lisäksi 4-hydroksiproliinilla on myös merkittävä rooli solujen vasteessa vähähappisille olosuhteille (hypoksia). Normaalissa happiosapaineessa (normoksia), hypoksiaindusoituvan tekijän (HIF) α-alayksikköön muodostuu HIF-P4H entsyymien katalysoimana kaksi 4-hydroksiproliinitähdettä, jotka kohdistavat α-alayksikön proteasomaaliseen hajotukseen. Hypoksiassa HIF-P4H:t eivät kykene toimimaan, jolloin α-alayksikkö säästyy hajotukselta, muodostaa kompleksin β-alayksikön kanssa ja sitoo transkriptiokofaktoreita. HIF-kompleksi kykenee tällöin lisäämään hypoksiassa tarvittavien geenien luentaa. Tänä päivänä tunnetaan kolme HIF α-alayksikköä, joista HIF-3α:sta tiedetään esiintyvän useita erilaisia silmukointimuotoja ja yhden näistä muodoista tiedetään toimivan negatiivisena säätelijänä hypoksiavasteessa. Tässä väitöskirjatyössä on tunnistettu neljä uutta HIF-3α:n silmukointimuotoa ja osoitettu että HIF-3α:n määrä kasvaa hypoksiassa HIF-1:n säätelemänä. Lisäksi sitoutumis- ja transkriptiokokeet paljastivat, että HIF-3α:n rooli hypoksiavasteessa on monimutkaisempi kuin aikaisemmin kuviteltiin.