Abstract

The G protein-coupled receptor 37 (GPR37) is a member of a large superfamily of integral membrane proteins involved in signal transduction across the cellular plasma membrane. G protein-coupled receptors participate in many vital physiological processes and form a major class of drug targets. GPR37 is abundantly expressed in the brain and has been linked to dopaminergic and adenosinergic signaling, as well as oligodendrocyte differentiation and myelination. Moreover, the receptor has been implicated in certain brain pathologies, the most notable of which is Parkinson’s disease. However, the endogenous ligand of GPR37 has not been identified, and thus, the potential of GPR37 as a therapeutic target remains unexplored. The mechanisms that regulate GPR37 in cells are poorly characterized. Therefore, this study aimed to shed light on the biosynthesis, maturation and processing of GPR37 by using a heterologous expression system and various biochemical and cell biological methods. In particular, the limited proteolysis of the receptor N-terminus and the enzymes involved in that process were assessed. The results show that GPR37 matures rapidly and efficiently. However, the N-terminal domain of the receptor is subject to proteolytic processing at Arg54↓Asp55 and Glu167↓Gln168. The cleavage at the Glu167↓Gln168 site is very efficient and occurs constitutively. The N-terminal ectodomain is shed from cells and the remaining truncated receptor represents the predominant GPR37 species at the cell surface. The cleavage at the Arg54↓Asp55 site is less efficient and takes place in the trans-Golgi network during receptor trafficking to the cell surface. Characterization of the cleaving enzymes revealed that GPR37 is processed by a proprotein convertase furin at the Arg54↓Asp55 site and by a disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10) at the Glu167↓Gln168 site. These findings were confirmed using various complementary methods and cultured cell lines of diverse tissue origin. Importantly, the ADAM10-mediated cleavage was also found to occur in a more physiological context of mouse brain tissue. This study reveals a novel processing mechanism for GPR37. N-terminal cleavage is likely an important element for receptor regulation, and the results pave way for strategies to exploit GPR37 as a therapeutic target.

Tiivistelmä

G-proteiiniin kytketty reseptori 37 (GPR37) kuuluu laajaan solun ulkopuolelta solun sisälle signaaleja välittävään kalvoproteiinien perheeseen. G-proteiiniin kytketyt reseptorit osallistuvat useisiin fysiologisesti merkittäviin toimintoihin, ja suuri osa markkinoilla olevista lääkkeistä vaikuttaakin solun toimintaan niiden kautta. GPR37 on aivoissa voimakkaasti ilmentyvä reseptori, jonka on osoitettu liittyvän muun muassa dopaminergiseen ja adenosinergiseen signalointiin sekä oligodendrosyyttien erilaistumiseen ja myelinisaatioon. Lisäksi GPR37 on yhdistetty eräisiin neurologisiin sairauksiin, joista merkittävin on Parkinsonin tauti. GPR37:n aktivoivaa ligandia ei kuitenkaan tunneta, ja tästä syystä reseptorin käyttöä lääkekohteena ei ole pystytty hyödyntämään. GPR37:n säätelyyn liittyvät mekanismit ovat huonosti tunnettuja. Siksi tässä työssä tutkittiin GPR37:n biosynteesiä ja prosessointia käyttäen heterologisia solumalleja sekä biokemiallisia ja solubiologisia menetelmiä. Työssä tutkittiin etenkin reseptorin aminoterminaalista proteolyyttistä prosessointia ja siihen liittyviä entsyymejä. GPR37:n havaittiin maturoituvan nopeasti ja tehokkaasti. Reseptorin solukalvon ulkopuolella sijaitseva aminoterminaalinen osa katkaistaan kuitenkin proteolyyttisesti kohdista Arg54↓Asp55 ja Glu167↓Gln168. Katkaisu kohdasta Glu167↓Gln168 tapahtuu tehokkaasti ilman ulkopuolista stimulaatiota. Aminoterminaalinen osa vapautuu soluista, ja jäljelle jäävä katkaistu reseptori edustaa solun pinnalla yleisimmin esiintyvää reseptorimuotoa. Katkaisu kohdasta Arg54↓Asp55 on tehokkuudeltaan heikompi ja tapahtuu trans-Golgissa reseptorin kuljetusreitillä solun pinnalle. Reseptorin katkaisuun liittyvien entsyymien karakterisointi osoitti, että proproteiinikonvertaasi furiini katkaisee GPR37:n kohdasta Arg54↓Asp55 ja metalloproteaasi ADAM10 kohdasta Glu167↓Gln168. Nämä havainnot vahvistettiin usealla toisiaan tukevalla menetelmällä käyttämällä erilaisia kudosalkuperiä olevia solulinjoja. Lisäksi ADAM10-välitteisen katkaisun havaittiin tapahtuvan myös hiiren aivokudoksessa, mikä vahvistaa löydöksen fysiologisen merkityksen. Tässä työssä tunnistettiin uusi mekanismi, jolla GPR37:ää muokataan soluissa. Aminoterminaalinen katkaisu on todennäköisesti tärkeä GPR37:ää säätelevä mekanismi, ja työn tulokset auttavat selvittämään reseptorin terapeuttista potentiaalia.